成果名称:采用CRISPR-Cas9技术制作多囊卵巢综合征大鼠模型的研究
登记日期:2019-10-18
完成单位:澳门送彩金网址大全,赛业生物科技有限公司
完成人员:韦相才,钟兴明,孙秀红,苗竹林,蒙伟能,郑生华,易升,井立鹏,刘洋,殷倩
研究起止日期:2015-05-01至2017-12-31
主要应用行业:卫生和社会工作
社会经济目标:社会发展和社会服务
评价单位:广东省科学技术厅
评价日期:2019-07-16
成果简介:课题来源与背景: 本课题为广东省自然科学基金项目《采用CRISPR-Cas9技术制作多囊卵巢综合征大鼠模型的研究》(编号:2014A020212229) 研究目的与意义:被课题旨在通过采用CRISPR-Cas9技术分别制备AR敲除和IRS-2敲除的纯合雌性大鼠,观察和分析模型的稳定性。鉴定和分析AR与IRS-2基因双敲纯合雌性大鼠是否具有PCOS表型特征,探讨PCOS可能的遗传学发病机理。获得国内稳定的遗传品系大鼠模型,更能稳定地观察和分析疾病的疾病特征,更好的从基因水平靶向性研究PCOS。从基因水平和遗传角度对PCOS的可能发病机理进行探索。采用全新的基因组定点编辑技术CRISPR-Cas9系统设计了分别单敲不同基因的技术方案,分析PCOS的分子机制,对后续PCOS的相关基因研究有重要创新价值。 主要论点与论据: 多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是临床常见的女性内分泌失调、生殖功能障碍和代谢紊乱性疾病,其确切病因、特殊病理变化及形成机制均尚未完全明确。研究发现PCOS有明显的家族聚集倾向,提示其具有很强的遗传易感性,遗传因素在一定程度上决定着PCOS的发生。鉴于PCOS生化特征和临床表现高度的异质性和复杂性,目前共识是它不是简单的单基因病,是多基因变异与环境因素共同作用的多基因病。实际工作中PCOS患者几乎不采取手术治疗,临床活体取材实验极其困难,因此制作稳定遗传品系的动物模型,对PCOS遗传-表型进行关联性研究,进一步揭示PCOS的发病机理具有深远意义。迄今为止,尚无涵盖PCOS所有表型并稳定遗传的动物模型。一个优秀的动物模型须尽可能满足与人类疾病比较的“三性”特征: 发病机理同源性、行为表象一致性、药物治疗预见性11及稳定的遗传品系。在利用新型遗传操作技术构建基因工程动物模型的进程上,我国处于技术跟踪阶段,而美国目前啮齿类人类疾病动物模型近万种。新型的生物工程学技术未得到充分应用,严重影响了PCOS易感基因的确定及相关功能学研究。自1960年以来,一系列动物(包括啮齿类、羊和灵长类)均被用来构建PCOS模型,这些模型多数具有卵巢多囊样变、与PCOS患者类似的激素和代谢改变。其中,啮齿类动物(SD大鼠为主)因其稳定的遗传背景,较短的生殖周期和动情周期,遗传操作的可行性、创建易行性、经济性等诸多优势成为建造基因工程动物模型的首选。目前,利用基因工程技术构建稳定遗传品系的动物模型成为基因功能研究异常活跃的领域之一。传统PCOS大鼠模型的构建常有雄激素(DHEA、T)法、雌激素法、来曲唑法、持续光照法等,均是人为地模拟PCOS的某个临床特征,没有稳定的遗传性,不适于遗传学研究。基因工程技术即基因敲除(Gene knockout),利用外源DNA可与活细胞染色体DNA的同源序列发生同源重组并定点修饰,克服了随机整合的盲目性和偶然性,获得较稳定的遗传品系。基因工程动物模型较传统动物模型能更准确地探讨相关基因的生物学功能,更稳定地观察疾病特征,更靶向性地研究PCOS病理通路。 创新: (1)采用最新的第三代 编辑技术CRISPR-Cas9 技术分别制备AR 敲除和IRS-2敲除的纯合雌性大鼠,观察和分析模型的稳定性。(2)从基因水平和遗传角度对PCOS 的可能发病机理进行探索。(3)采用全新的基因组定点编辑技术CRISPR-Cas9 系统设计了分别单敲不同基因的技术方案,分析PCOS 的分子机制,对后续PCOS 的相关基因研究有重要创新价值。(4)采用全新的基因组定点编辑技术CRISPR-Cas9 修饰大鼠AR 及IRS-2 双基因。首次把PCOS 建模的两大切入点——高雄激素和胰岛素抵抗相结合制作大鼠模型。利用基因工程技术构建遗传稳定性、表型全面性的新型PCOS 动物模型,是之前任何一种动物模型所不能及的。(5)比较并评价单敲除AR 基因和单敲除 IRS-2 基因的模型效果,摸索并设计了双敲基因的技术方案。分析PCOS 发生AR 和ISR-2 基因的分子机制,对后续PCOS 相关基因及生物学功能、病理生理通路研究有重要创新价值。同时对双基因联合敲除技术进行探索。 存在的问题: 定点敲除AR 和IRS-2 双基因不是PCOS 制备的经典方法,根据我们实验数据显示敲除AR 和IRS-2 双基因的雌性大鼠具有PCOS 的一些特征,但不具备PCOS 全部特征,且同时敲除两个基因会产生其他的疾病尚不可知;虽然目前CRISPR/ Cas9 在分子生物学领域取得取得里程碑式的研究进展,但伴随其的脱靶效应等问题,仍值得关注。本实验中,我们敲除AR 和IRS-2 后,PCR 检测敲除大鼠的基因型,也观察到脱靶现象;本实验选取的是AR 和IRS-2 这两个基因,后续研究中能否选取其他和PCOS相关基因进行研究,进一步探讨这些基因和PCOS 的确切关系,为早期发现及有效干预PCOS 提供药物靶点和预防方法,有效促进改善妇女的生殖健康。 论文发表情况: 利用CRISPR/Cas9技术制备敲除AR和IRS2基因大鼠 Association between polymorphisms in TLR4 gene targeted by microRNA-140 and cervical precancerous lesion in south Chinese women: a case control study Association Between MALAT1 and THRIL Polymorphisms and Precancerous Cervical Lesions